BECKER, J. M. DEPARTMENT OF MICROBIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, CELLULAR, AND MOLECULAR BIOLOGY. THE UNIV
Prácticas: Técnica aséptica y obtención de cultivos puros: Aislamiento en placa y transferencia de cultivos. Preparación de medios de cultivo. La curva de crecimiento. Aislamiento de DNA plasmídico de Escherichia coli: La minipreparación. Purificación, concentración y cuantificación del DNA. Aislamiento a gran escala de DNA plasmídico por cromatografía en columna. Amplificación de un fragmento que contiene el gen lacZ con la reacción en cadena de la polimerasa. Digestión del DNA con enzimas de restricción y electroforesis en geles de agarosa. Transferencia Southern. Preparación, purificación e hibridación de una sonda. Transformación de Saccharomyces cerevisiae. Aislamiento de plásmidos de levaduras y transformación de Escherichia coli. Determinación de proteína. Ensayo cualitativo de la ß-galactosidasa en colonias de levadura. Determinación de la actividad ß-galactosidasa en células de levaduras permeabilizadas. Ensayo de la actividad ß-galactosidasa en extractos proteicos acelulares. Purificación de la ß-galactosidasa. Transferencia Western: investigación de un gel transferido de proteínas con anticuerpos contra la ß-galactosidasa. Apéndices: Protocolos y experimentos alternativos. Aislamiento y caracterización de mutantes auxótrofos de levadura. Medición del pH. Empleo del espectrofotómetro. Aislamiento de DNA plasmídico: la maxi-preparación. Hibridación en colonias. Soluciones tampón. Preparación de tampones y soluciones. Propiedades de algunos ácidos y bases concentrados. Uso de la micropipeta. Manipulación segura de microorganismos. Listado de microorganismos. Conservación de microorganismos y de DNA. Métodos de esterilización. Preparación de soluciones stock para medios de cultivo. Crecimiento en medio líquido. Recuento de células viables. Determinación de la masa celular. Determinación del número de células. Nomenclatura de las cepas. Material de vidrio y de plástico. Preparación de tris y EDTA. Reglas básicas de manipulación de enzimas. Efecto de los contaminantes más comunes sobre los ensayos de proteína. Direcciones de fabricantes y distribuidores. Navegando por bionet. Direcciones en la World Wide Web. Glosario.
